多重PCR的小技巧，您get到了吗？ |
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上期我们讲了多重PCR技术的原理、优势，以及应用的广泛性。其原理与常规PCR无任何区别，但在实际的操作过程中，我们往往会遇到各种问题。所以，为了获得更好的扩增效果，我们经常需要进行各种优化。 |
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引物设计 在多重所有的引物对必须优化到相近的扩增条件。因此多重PCR的引物设计除了要满足一般PCR引物设计的原则外,还要注意以下几个问题：各引物之间不能互补，尤其避免3’端互补,以免形成二聚体，各引物与其它扩增片段和模板不能存在较大的互补性，扩增片段之间也不能有较大的同源性；对于引物的长度（一般18-24nt）、(G+C)含量、Tm值要求尽可能一致；各引物扩增产物的片段大小要有一定的差别，以便于用电泳的方法进行区分。 |
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反应体系 |
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多重PCR的反应体系是扩增效果的重要因素之一，体系中的各组分需满足每对引物对应的靶点的扩增量要求。 |
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反应条件 |
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由于在一个多重PCR反应体系中有多对引物,而且扩增的模板片段长度也不尽相同,所以各对引物的扩增效率和扩增速度也不相同。由于多重PCR反应总是遵循较小片段优先扩增的原则,各对引物所要求最佳PCR条件也不尽相同(设计多对引物进行多重PCR时,应使各引物所需PCR扩增条件尽可能一致,因此在选择多重PCR扩增条件(尤其是退火温度和时间)时应尽量选择有利于较大片段扩增的条件。 |
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常见问题及解决办法 |
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多重PCR扩增的时候最主要的问题：引物二聚体、非特异性扩增以及扩增产物条带弱等问题。在实际的操作过程中，我们可以根据一下的问题及相应解决办法进行调整。 |
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多重PCR要求在同一反应体系中对多位点进行特异性扩增。因而引物间的配对与竞争性扩增均会影响扩增效果。如果能选择合适的反应体系以及反应条件则可能提高多重PCR的扩增效果。因此，在实际的操作过程中，应根据自身的实验情况对实验条件进行优化，达到最佳的扩增效果。 |
