qPCR 数据分析

qPCR 数据分析

师兄、师姐毕业压力大，忙于做实验、写论文，没空带你，而老板又不停催着要结果，实验不顺手，数据分析有一头雾水，怎么办，是不是很抓狂，是不是很心塞，是不是很煎熬？

　没事，小编为大家排忧解难来了，前几期我们给大家分享了关于qPCR的进化史，引物的设计，实验的设计，反转录的解决方案，本期给大家分享qPCR实验主题的最后一个内容—数据分析，让您的数据结果更加准确，让老板对您刮目相看，是不是很期待呢？

　　qPCR的数据分析根据应用的不同可以分成相对定量和绝对定量两种。例如，处理组细胞与对照组细胞相比，A基因的mRNA改变了多少倍，这就是相对定量；那如果说在一定数目的细胞中，A基因的mRNA有多少个拷贝，这就是我们说的绝对定量。通常在实验室中用的最多的就是相对定量的方法了。首先我们先了解一下绝对定量的原理及数据分析流程。

绝对定量的原理和方法

Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系，即

Log2X0 = Log 2M - Ct Log2（1＋En）

根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。

对于绝对定量我们需要确定几个要素：

•　一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。

•　一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。

•　重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保区分并去除因加样失误导致的误差孔。

•　标记方法的选择 ——SYBR Green I 法或Taqman 探针法均可。

•　实验结果显示 ——扩增曲线；标准曲线；融解曲线(探针法不需要)。

我们以染料法为例，给大家展示在绝对定量中的分析流程：

质粒标准品的制备：

首先设计一对引物从基因组DNA上扩增一段含有目的基因的片段，一般来说这个片段最好是比qPCR扩增的目的片段长100bp左右，然后将扩增的片段连接到载体上构建质粒载体，再转到大肠中进行克隆复制，经过质粒的提取及OD值定量或qubit定量（qubit定量从原理上来说要比OD值测定更准确，因此推荐qubit进行质粒浓度测定，推荐使用启衡星qubit试剂盒，性能优越，稳定），我们就可以将质粒梯度稀释得到一组标准品。 

质粒标准品拷贝数的计算及稀释方法

拷贝数的计算

1OD260=50ng/μL双链DNA，待测样本浓度（ng/μL）= OD260×50（×稀释倍数）

1μL双链DNA标准品物质的量（mol）=(稀释倍数×OD数×50×10-9)/（序列长度×649）

1μL双链DNA标准品的数量（copies）=(稀释倍数×OD数×3×1016)/（序列长度×649）

质粒标准品倍比梯度稀释方法：

1V原液（标准品Ⅰ）+ 9V稀释缓冲液，得标准品Ⅱ

1V标准品Ⅱ+ 9V稀释缓冲液，得标准品Ⅲ

1V标准品Ⅲ+ 9V稀释缓冲液，得标准品Ⅳ

1V标准品Ⅳ+ 9V稀释缓冲液，得标准品Ⅴ

绝对定量实验例-拟南芥中A基因的绝对定量

试剂：启衡星SYBR Green qPCR Mix

标准品：质粒标准品设置5个浓度梯度，分别3个重复；并设置阴性对照；

实验步骤：设计A基因qPCR特异性引物

          提取拟南芥基因组DNA

          荧光定量PCR 扩增实验

          结果分析，计算得出拟南芥样品中A基因的copy数。

标准曲线制作：利用Mean Ct 作图可得到标准曲线

y = -3.481x + 40.123   R2 = 0.9996

扩增效率（E）计算

E =10-1/斜率-1

=10-1/-3.481 -1

=1.983-1

=0.938

相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。

扩增效率（E）：0.8-1.2, 越接近1，越理想。 

标准差STD一般要求小于0.5，在比较严格的实验中，要求小于0.2。  

样品中A基因的拷贝数计算：

将Ct值带入线性方程：

18.45= -3.481 X +40.123中，即可计算出未知样品的拷贝数；

将Ct值带入线性方程：

18.45= -3.481 X +40.123

相对定量

比较两个或两个以上样本中、或处理组与对照组某个基因表达量的变化

适用于您只关注样本间基因表达量的差异，不关心某基因的绝对表达量；

同样，对于相对定量，我们也需要关注几个因素：

•一个参照样本

•一个或一个以上的未知样本

•目的基因

•一到两个管家基因——用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量（对于管家基因的选择我们上上期的内容-实验室设计中已经给大家分享，大家可以翻阅我们前期的内容进行查阅）

•重复反应孔——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保区分并去除因加样失误导致的误差孔。

•标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可

•实验结果显示——扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线（探针法不需要）

•标准样本（有些分析方法不需要）

对于相对定量，最常用的有两种方法：

（1）双标准曲线法

通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行绝对定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。

双标准曲线法实验例-盐处理油菜中A基因的相对定量

试剂：启衡星SYBR Green qPCR Mix

标准品：质粒标准品设置5个浓度梯度，分别3个生物学重复；每个样品同样设置3个生物学重复，并设置阴性对照；

实验步骤：设计A基因qPCR特异性引物

          提取处理组、对照组的RNA，并反转录为cDNA

          荧光定量PCR 扩增实验

          结果分析，计算出待测样品1和2与对照组相比目的基因A的表达量是上升了，还是下降了？

实验数据

从定量结果可以看出，待测样品1和2相对于对照样品在目的基因A的表达量上有所下降。

总结：

双标准曲线法优点：数据最准确，不用考虑扩增效率不好的影响；分析简单，实验优化相对简单

双标准曲线法缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线

应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一

（二）相对定量分析－－2－△△Ct法

公式

2－△△Ct法实验例--胁迫处理后，油菜中A基因的相对定量

2 - △△Ct法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100%

△Ct（处理前）＝15－13＝2     △Ct（处理后）＝18－20=－2

△△Ct=△Ct（处理后）－△Ct（处理前）＝－2－2＝－4

比率（处理后/处理前）＝2－△△Ct＝2－（－4） ＝16

所以目的基因在处理后表达水平是处理前的16倍

小结

•优点：无需作标准曲线，实验流程相对简单；

•缺点：

            假定扩增效率为 100 %；

            假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；

            实验条件优化较为复杂。

因此采用此方法进行计算分析，再我们不知道扩增效率的时候，我们得到的结果可能会与实际结果有很大偏差。但是它也可以通过做标准曲线，看扩增效率进行校正，因此在实际操作的时候，推荐大家做一下标准曲线，看实际的扩增效率然后进行结果的校正，确保更准确的结果。

修正方法：如果我们知道目的基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于2，那么2－△△Ct可以修正为：E－△△Ct，例如扩增效率为1.95，那么计算公式可修正为

1.95－△△Ct

2－△△Ct法是基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一

了解完qPCR的分析方法之后，是不是思路清晰多了呢，期待您有好的收获，本期的内容就到此结束啦，记得关注我们哦，更多精彩内容，敬请期待！