| 实时荧光定量PCR技术（Realtime quantitative PCR，qPCR）是在PCR反应体系中添加荧光报告基团和荧光淬灭基团，通过荧光信号来实现对核酸分子的定量检测过程。 在反应过程中，PCR产物随着扩增反应的进行不断生成，荧光信号不断增加，进而可以通过荧光信号的变化对整个PCR过程进行实时监测，并通过标准曲线对原始模板进行定量分析。 本文将从实时荧光定量PCR的反应阶段、常用参数、定量分析原理、常见分类、不同方法的优劣势等五个方面进行详细介绍。 1、反应阶段 实时荧光定量PCR的整个反应过程可分为基线期、 指数期和平台期３个阶段：
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| 2、常用参数 |
为了便于定量分析，在qPCR反应中引入了荧光阈值和循环阈值（Cyclethreshold，Ct）两个概念：
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| 3、定量分析原理 |
| 在反应体系中，若设计一定的荧光阈值，起始模板量越大，其达到荧光阈值所需的循环数越小，则Ct值越小。 在实验过程中，利用已知起始拷贝数的标准样品绘制标准曲线，由于待测样本PCR扩增产物数量与荧光基团发出的荧光强度呈对应关系，只要通过qPCR得到待测样本的Ct值，即可通过标准曲线计算待测样本的起始拷贝量。 |
| 4、常见分类 |
| 目前，根据所用荧光物质的化学原理和PCR检测的特异性，可将qPCR其分为两大类： |
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| DNA染料法 |
| 荧光染料可以快速掺入DNA双链与之结合，发射荧光信号，而不掺入双链中的荧光染料分子不会发射任何荧光信号，可以对特异性和非特异性的PCR扩增产物进行检测，例如SYBR GreenＩ和Eva Green。 |
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| 荧光探针法 |
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可分为Taqman探针法和分子信标探针法。 ①Taqman探针法是在PCR扩增时在加入一对引物的同时，再加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 当探针完整时，报告基团发出的荧光信号正好被淬灭基团吸收，体系中没有荧光信号；随着反应的进行，探针被Taq酶的5’-3’外切酶酶切降解，使报告基团与淬灭基团分离，信号检测系统接收荧光信号。 |
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②分子信标是种由于碱基互补形成的茎环结构的寡核苷酸，由于荧光基团与猝灭基团靠得很近，荧光被淬灭。 PCR扩增过程中随着DNA双链解链，信标的茎环与暴露的DNA靶序列杂交，互补区被拉开，致使荧光基团和泮灭基团之间距离增加，荧光恢复。 |
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5、三种qPCR方法的优劣势 |
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启衡星PCR/RT-PCR/qPCR产品列表 |
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