胶回收/PCR纯化翻车？避坑秘籍助你高效回收！

一、 回收率低：DNA去哪了？

1.  膜结合液(MB)用量不当：

       问题： 加液比例错误影响DNA结合效率。

       解决： 严格按1:1比例加入（即每1mg凝胶或每1μl DNA溶液加入1μl MB）。

2.  离心力不足或时间过短：

       问题： DNA未充分与硅胶膜结合。

       解决： 离心时确保转速≥12,000 rpm。若离心机达不到该转速，需相应延长离心时间，保证溶液完全通过硅胶膜。

3.  膜漂洗液(MW)未添加乙醇：

       问题： MW溶液未按说明添加乙醇，导致洗涤效果不佳，杂质残留。

       解决： 使用前务必确认乙醇已按比例加入MW瓶中。

4.  洗脱条件不佳：

       问题： 洗脱液pH值不合适或体积过小，影响DNA从膜上解离。

       解决：

• 优先使用试剂盒提供的洗脱缓冲液(EB)。
• 若用去离子水洗脱，必须将pH值调整至7.0-8.5。
• 洗脱体积≥30μl，滴加至硅胶膜中央，静置1分钟使膜充分浸润后再离心。

二、 回收产物测序结果不佳：信号弱或干扰大

1.  DNA模板量不足：

       问题： 测序信号弱。

      解决： 提高测序反应中DNA用量。若回收产物浓度过低，可通过乙醇沉淀法浓缩后再使用。

2.  DNA模板量过高或存在抑制剂：

       问题： 过量DNA或杂质干扰测序反应。

• 适当降低测序DNA用量。必要时，用EB或灭菌双蒸水稀释回收产物。

3.  DNA损伤：

       问题： 紫外照射导致DNA损伤（如嘧啶二聚体）。

       解决： 切胶动作迅速，最大限度减少DNA在紫外灯下的暴露时间。

三、 酶切效果不佳：切不动或切不干净

1.  内切酶本身问题：

     问题： 酶失活或操作不当。

     解决： 严格遵循厂家说明书操作（温度、Buffer、时间等）。设立阳性对照检测酶活性。

2.  回收产物中抑制剂残留：

       问题： 膜漂洗液(MW)中的乙醇或盐离子未去除干净，抑制酶活。

       解决： 确保洗涤步骤离心彻底，必要时开盖短暂放置让残留乙醇挥发。若问题持续，可对回收产物进行再次乙醇沉淀纯化，并注意DNA溶液体积不超过酶切反应总体积的10%。

四、 电泳异常：上样漂出或条带模糊

1.  上样孔漂出：

       问题： 样品密度不足或含挥发性成分。

       解决：

• 务必添加上样缓冲液（含甘油/蔗糖增加密度，染料指示进程）。
• 彻底去除残留乙醇(MW的主要成分)，方法同上（充分离心、开盖挥发）。

2.  条带不锐利（拖尾、弥散），DNA完整性或纯度受损。

       解决：   

•  操作轻柔，尤其是回收大片段DNA时，避免剧烈振荡、吹打等机械损伤导致DNA断裂。
•   严防交叉污染：使用新配制的琼脂糖凝胶和电泳缓冲液，保持切胶刀片清洁。
•   防止DNA降解：切下的胶块如不能立即回收，应置于4℃保存。

五、 克隆效率低：转化不出或背景高

1.  吸附柱漂洗不彻底：

       问题： 残留抑制剂影响连接或转化效率。

       解决： 对回收产物进行再次乙醇沉淀纯化。

2.  DNA末端损伤：

       问题： 回收过程中可能引入外切酶污染，导致末端缺失。

       解决： 使用新鲜配制的电泳相关试剂（胶、缓冲液），回收操作尽量保证无菌。

3.  感受态细胞效率差：

       问题： 细胞本身转化效率低。

   解决： 检查感受态细胞的制备和保存方法是否正确，必要时更换或重新制备高效感受态。

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